什麼是二抗（Secondary Antibody）？

二級抗體（Secondary Antibody，簡稱二抗）是能專一性辨識並結合一級抗體（Primary Antibody）的免疫球蛋白。在免疫實驗中，二抗通常結合了酶（如 HRP、AP）或螢光染劑（如 FITC、DyLight^™、ATTO、Cy^® 等），作為信號放大的關鍵角色。相較於一抗直接識別標的蛋白，二抗利用一個一抗可結合多個二抗分子的特性，能顯著放大偵測訊號，提升實驗敏感度。二抗廣泛應用於 Western Blot（WB）、免疫組織化學染色（IHC）、免疫螢光染色（IF）、ELISA、流式細胞分析（Flow Cytometry）以及多重螢光染色（Multiplex assays）等。選擇適合的二抗時，需依據一抗的宿主物種（Host Species）、抗體類型/亞型（Class/Subclass）、實驗應用及偵測標定物（Conjugate）進行評估。騰達行是 Rockland 原廠認證的台灣代理商，提供 Rockland 全系列二抗的詢價、訂購與技術諮詢。

一抗與二抗的偵測原理示意

二抗選購指南與核心步驟

1. 匹配一抗宿主物種（Reactivity / Target Species）
二抗的辨識對象必須是一抗的宿主物種，但二抗本身的生產宿主（Host）必須與一抗的宿主不同
例如：若一抗為 Rabbit Anti-Protein X，則二抗應選擇 Goat Anti-Rabbit IgG 或 Donkey Anti-Rabbit IgG。

2. 確認一抗的類別與亞型（Specificity / Class & Subclass）
> Polyclonal 一抗：通常選擇能辨識重鏈與輕鏈的 Anti-IgG (H&L) 通用型二抗。
> Monoclonal 一抗：選擇針對特定亞型（如 Anti-Mouse IgG1 或 Anti-Mouse IgG2a）的二抗，能避免不同小鼠單株抗體之間的交叉干擾。

 

抗體類型與亞型（Class/Subclass）詳細解析 了解一抗的 Class 與 Subclass，是精準選擇二抗且避免實驗失敗的關鍵。 1. 抗體類型（Class / Isotype） 免疫球蛋白依其重鏈恆定區結構的不同，分為五大類型： IgG：血清中最主要的抗體（佔約 80%），也是絕大多數科研一抗與二抗的類型。 IgM：多為五聚體，多用於初次免疫反應或特定的血型/糖蛋白研究。 IgA：主要存在於黏膜分泌物中。 IgE / IgD：分別參與過敏反應與 B 細胞發育，科研應用較少。   2. 抗體亞型（Subclass） 在同一類型（如 IgG）中，依Hinge region及二硫鍵結構差異，不同物種有不同的亞型分類：   物種 (Species) 常見 IgG 亞型 (Subclasses) Mouse (小鼠) IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 Rabbit (兔子) 主要為單一分子結構 (IgG) Human (人類) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 Rat (大鼠) IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c   3. 評估樣品物種與交叉反應（Pre-adsorption Needs） 若實驗樣品本身含有大量內源性免疫球蛋白（如小鼠組織切片），或需同時使用多種不同物種的一抗進行多重染色，應優先選擇經過 Pre-adsorbed（預吸附 / 交叉吸附）處理的二抗，以消除背景雜訊。   4. 選擇適合實驗的標定物（Conjugate / Reporter） > 酵素標定（Enzyme Conjugates）：如 HRP (Peroxidase) 或 AP (Alkaline Phosphatase)，適用於 WB、ELISA 及 IHC 呈色。 > 螢光標定（Fluorophore Conjugates）：如 FITC、TRITC、Texas Red®、DyLight™、ATTO 染劑及 Cy3/Cy5 等，適用於 IF、流式細胞儀及 Multiplex 多重螢光影像系統。 > 生物素標定（Biotin Conjugates）：搭配 Streptavidin-HRP/ 螢光物，能進一步放大極微量蛋白的訊號。

 

特殊功能與高規格二抗分類

分類	特點與適用時機
Pre-adsorbed Secondary Antibodies	二抗在純化過程中，預先通過固相化其他物種血清蛋白的管柱，預先吸附並去除會發生交叉反應的非專一性抗體。適合多重標定（Multiplexing）、組織內含有高背景血清蛋白，或一抗宿主與樣品物種接近時使用，能大幅降低非專一性背景。
Fab / F(ab')2 Fragment Antibodies	去除Fc 區的抗體片段。因為沒有 Fc 區，不會與細胞或組織上的 Fc 受體（Fc Region）結合，能減少背景雜訊，且片段體積小、組織穿透力更佳，極適合 IHC/IF 及封阻（Blocking）實驗。
TrueBlot® 二抗	專為免疫沉澱後進行 Western Blot（IP-WB）設計。僅識別原生（Native）非變性的一抗，不會辨識變性後重鏈（~50 kDa）與輕鏈（~25 kDa），能避免二抗干擾目標蛋白位置的判讀。

代表產品
Pre-adsorbed
> 610-1319：Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Pre-Adsorbed (HRP)
> 611-156-122：Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Pre-Adsorbed (ATTO  647N Conjugated，適合高解析度螢光顯微鏡與 Multiplex)
> 610-145-002：Goat Anti-Mouse IgG (H&L) DyLight™ 800 Conjugated

 

Fab / F(ab')2
> 811-1602：Fab Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Biotin Conjugated
> 709-1317：F(ab')2 Goat Anti-Human IgG Fc Pre-Adsorbed (HRP)

 

TrueBlot^® 二抗
> 18-8817-31：Mouse TrueBlot^® ULTRA: Anti-Mouse Ig HRP
> 18-8816-31：Rabbit TrueBlot^® ULTRA: Anti-Rabbit IgG HRP

 

不同抗體形式的示意圖

圖片來源 : Front. Immunol., 28 August 2020

常見問題（FAQ）

Q1. 二抗背景很高，可以先從哪裡調整？
先做「只加二抗、不加一抗」的對照，確認背景是否來自二抗。封阻時建議使用與二抗同一宿主的正常血清；若使用 BSA 後仍有背景，可嘗試更換 blocking reagent，因不同 BSA 等級或樣品條件可能造成非特異性反應。若背景仍高，可改用預吸附二抗或 Fab／F(ab')2 片段二抗（見上述特殊功能與高規格二抗分類）。

Q2. HRP 與 AP 標記怎麼選？
HRP 反應快、品項多，是 WB 與 ELISA 最常見的選擇；AP 可搭配不同 substrate 產生顯色訊號，可作為 HRP 的替代選擇；例如在樣品具有較高 endogenous peroxidase 活性時。

Q3. 二抗一定要和一抗用同一個品牌嗎？
不需要，只要宿主物種、類別／亞型與標記方式相符即可。不過不同廠牌的二抗在純化、預吸附條件與標記效率上可能不同，正式實驗前建議以陽性與陰性對照確認。

Rockland 二抗優勢

嚴格的 Pre-adsorption 技術，極低背景雜訊
Rockland 擁有頂尖預吸附純化技術，能有效去除與非目標物種血清蛋白的交叉反應，特別適合高靈敏度的多重螢光標定 (Multiplexing) 與組織切片染色。

批次間一致性（Batch-to-Batch Reproducibility）
所有二抗均經過嚴格的質量控制（QC），包括 SDS-PAGE 純度分析、免疫電泳（IEP）及具體應用（WB、IHC、IF）的驗證，確保每批次實驗結果皆具備高度重現性。

多元的標定物選擇（Wide Range of Conjugates）
提供完整的標定選項，涵蓋傳統酵素標定（HRP、AP）、生物素（Biotin），以及新一代高穩定性、高光強度的螢光染劑（如  DyLight^™、ATTO 等），滿足各式儀器與波長需求。

完整包含高階片段抗體（Fab & F(ab')2 Fragments）
針對高背景與細胞 Fc 受體干擾問題，提供 Fab 與 F(ab')2 片段二抗，能顯著提升組織滲透力並消除非專一性結合。

獨家專利技術（TrueBlot^®）解決傳統實驗干擾
針對 IP-WB（免疫沉澱後進行 Western Blot）專利研發的 TrueBlot^® 技術，能完全消除變性重鏈（~50 kDa）與輕鏈（~25 kDa）干擾，精準呈現標的蛋白條帶。

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