在 分子檢測 (定序) 篇 已經介紹過可以用於檢測病毒全基因體序列的定序方法，這篇主要著重介紹新冠病毒入侵宿主後或是治療後的宿主體內免疫系統變化的定序分析方法 – Immune Profiling。

在成熟的 B cell 與 T cell 表面存在抗原識別受體蛋白，分別可稱為 B Cell Receptor (BCR) 與 T Cell Receptor (TCR)。在生物體中，為識別各種入侵的抗原及激活免疫反應，BCR 與 TCR 表現出高度的多樣性，這種多樣性主要體現在 V(D)J 可變區的重組及 clonotypes 的構成。透過 NGS 技術來解答 BCR 或 TCR clonotypes 的多樣性是否發生變化，找到正確的雙鏈配對資訊，以幫助研發疫苗或抗體藥物。

免疫組庫是指在任何指定時間，個體的循環系統內所有功能多樣性 B cell 和 T cell 的總和 (免疫系統的多樣性對機體健康相當重要，多樣性越高，免疫系統就越強大)。生物體的後天性免疫 (adaptive immunity) 能識別無數種抗原分子並隨之做出反應，其分子基礎為 TCR 和 BCR 特異性地識別抗原區段進而激活免疫反應。這意味著 TC​​R 和 BCR 需呈現高多樣性，具有識別各種各樣抗原的可能，而多樣性體現來源為 receptor gene V(D)J 片段的重組，因此分析多樣性主要是分析 V(D)J 片段的序列特徵。

傳統方法包括 Cloning、Sanger Sequencing 或抗原特異性功能驗證 (例如 MHC Tetramer Staining)。不過這些方法通量較低，無法對免疫組庫多樣性提供完整、正確分析。大約於 2009 年開始，科研人員開始採用 NGS 技術分析免疫庫，大大地提升了分析規模與通量。由此，NGS 成了免疫組庫主流的分析方法。

每個細胞僅一條 DNA 模板，理論上以 DNA 起始更容易確定 clonotypes 的相對豐度。但是，每個細胞可能有多個 copies 的 TCR or BCR 轉錄體，因此以 RNA 為模板會更靈敏，對特定的 receptor variants 分析更完整，包括稀有表達的 receptor。此外，mRNA 定序分析的是已表達並經剪切、轉錄後加工的 receptor 序列，更容易獲得功能蛋白訊息。相反，基於 DNA 的方法會得到大量與功能無關的序列訊息。

一些研究只關注 TCR 或 BCR 序列的 CDR3 區域 (Complementarity-determining region 3)，這是由於 CDR3 區包含抗原-受體 (receptor) 作用的核心位點，也是變化最多的區域。然而，全長定序能提供receptor序列額外的區域信息 (包括 CDR1 & CDR2)，這些區域參與抗原-受體結合的親和性、下游信號傳遞。另外，獲得的全長序列還可應用於 cloning 實驗，對抗體及 T cell 治療的研發尤為重要。

常見的兩種免疫組庫 NGS 基因庫製備技術包括 Multiplex PCR 與 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)。

Multiplex PCR 可以以 DNA 或 RNA 作為樣本來源，通常會進行兩輪的 PCR：第一輪 PCR 擴增出 receptor基因後，於第二輪 PCR 加入帶有 adapter 和 index 的 primer 擴增出已知的序列。然而，第一輪 PCR overlap sites的primer 位點存在高多樣性，需大量 degenerate primer，因此容易導致 PCR bias。

另一種技術整合了 SMART (Switching Mechanism at 5’end of RNA Template) 與 5’RACE。這種技術只適用 RNA 作為模板，每輪 PCR 僅需一對 primer，能顯著降低 PCR bias，確保結果反映樣本的真實情況，並且具有更高的 on-target 率，能降低定序成本。

Takara Bio 推出的 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2 和 SMARTer® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit 能分別能提供 human TCR、BCR clonotypes 更正確的分析結果。

References：

寶日醫生物技術免疫組庫分析