研究病毒感染機制：致病機轉探討
新冠病毒的基因組主要紀錄數個必要及非必要的基因序列，包含棘狀蛋白(spike protein, S)、膜蛋白 (membrane protein, M)、外套膜蛋白 (envelope protein, E)、核鞘蛋白 (nucleocapsid, N) 等。
科學家先前已破解新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2) 入侵人體宿主細胞需要兩個關鍵蛋白：
1. ACE2 ( Angiotensin-converting enzyme 2; 第二型血管收縮素轉換酶)。
2. TMPRSS2( Transmembrane Serine Protease 2; 絲胺酸蛋白酶 )。
SARS-CoV-2 會結合宿主細胞的 ACE2 receptor，然後 TMPRSS2 活化 SARS-CoV-2 的棘狀蛋白 (spike protein)，協助病毒入侵宿主細胞。然而，哪些細胞會表現這兩種關鍵蛋白，卻一直沒有得到證實。
另一個 Furin 蛋白或許也扮演著重要的角色，棘狀蛋白含有 Furin (Spike Protein Cleaving Enzyme) 切割位，Furin 會將棘狀蛋白切割成 S1 和 S2 兩個蛋白。S1 蛋白上具有 RBD (Receptor Binding Domain)，和宿主的 ACE2 具有高度的親和力; 而 S2 蛋白則是含有高度的保留區和冠狀病毒的鑑定有關。
SARS-CoV-2 蛋白研究工具
病毒-宿主蛋白質交互作用
酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid; Y2H) 技術，是一種實驗室常用的經典蛋白質交互作用研究方法。真核模式生物酵母的起始轉錄，是需要轉錄因子參與調控的，研究發現酵母的轉錄因子 GAL4 含有兩個結構域，分別是 DNA-binding domain (DNA-BD) 和 transcription activation domain (AD)，這兩個結構域分開時，仍分別具有功能但不能活化轉錄，只有二者非常接近時才能形成完整的轉錄因子 GAL4 從而激活轉錄發生。基於此發現，可以將一個已知蛋白質與 DNA-BD 融合表達 [稱之為誘餌蛋白質 (bait)]，將另一種蛋白質與 AD 融合表達 [稱之為獵物蛋白質 (prey)]。如果兩個蛋白質之間有相互作用，就會形成完整的轉錄因子 GAL4，從而活化基因表達。
如果我們以病毒的某種蛋白質和 DNA-BD 融合表達作為 prey，再從宿主細胞中提取 RNA 構建基因庫，通過酵母雙雜交 (Y2H) 方法我們就可以篩選出究竟是哪個宿主蛋白質與病毒的蛋白質有相互作用，後續就能以此為依據解析病毒入侵的機制，甚至可以嘗試加入藥物來抑制蛋白質互作關係，從而找出對抗病毒入侵的特效藥物。
以下是幾篇酵母雜交 (Y2H) 技術應用於病毒蛋白質與宿主蛋白質交互作用的研究文獻：
Chen Y , Cai H , Pan J , et al. Functional screen reveals SARS coronavirus nonstructural protein nsp14 as a novel cap N7 methyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(9):3484-3489.
這篇主要的研究目標是 SARS 冠狀病毒 (SARS-CoV)，作者採用酵母雙雜交的方法，以 SARS 冠狀病毒的 spike (S) 蛋白質作為 prey，從 HeLa 細胞構建的 cDNA 基因庫進行交互作用蛋白質的篩選，發現真核起始因子 eIF3 的一個亞基 eIF3f 可能與 SARS-CoV spike (S) 蛋白質的 N 端區域具有相互作用。後續又通過 IP 及 IF 進一步確認蛋白質交互作用。通過實驗分析表明，冠狀病毒 S 蛋白質和 eIF3f 之間的相互作用在控制宿主基因的表達方面起到抑制作用，揭露了 SARS 病毒發病的新機制。
Rivera J , Abrams C , Hernaez B , et al. The MyD116 African Swine Fever Virus Homologue Interacts with the Catalytic Subunit of Protein Phosphatase 1 and Activates Its Phosphatase Activity. Journal of Virology, 2007, 81(6):2923- 2929.
作者通過 Y2H 的方法發現 Protein Phosphatase 1 (PP1) 與非洲豬瘟病毒的 DP71L 蛋白質具有特異性相互作用。通過檢測感染了病毒的 Vero 細胞中 PP1 和 PP2A 的水平，研究了這種相互作用的功能和效應。
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應用 |
品名 |
貨號 |
包裝 |
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Bait 製備 |
630489 |
Each |
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Prey 自行製備 |
630490 |
5 Rxns |
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Prey Libraries |
多種，請參考網頁 |
Each |
SARS-CoV-2 Pseudovirus
在進行致病機轉的研究時，研究學者希望能以表面膜蛋白為 SARS-CoV-2“ S” spike glycoprotein 的偽病毒 (pseudovirus) 進行實驗，這樣一來就可以在更安全 (BSL2) 的條件下進行 SARS-CoV-2 相關研究，包括中和測定 (neutralization assay ) 以及病毒與宿主表面蛋白的相互作用的研究。
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應用 |
品名 |
貨號 |
包裝 |
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pPACK-SPIKE SARS-CoV-2 “S” Pseudotype Lentivector Packaging Mix |
CVD19-500A-1 |
10 Rxns |
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pPACK-SPIKE SARS-CoV-2 “S” Pseudotype Lentivector Packaging Mix (XL) |
CVD19-510A-1 |
25 Rxns |
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pPACK-SPIKE Combo Kit, includes Cat# CVD19-500A-1, plus PureFection Transfection Reagent (Cat# LV750A-1) and PEG-it Virus Concentration solution (Cat# LV810A-1) |
CVD19-520A-KIT |
1 Kit |
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“Spike” Pseudotyped D614G Mutant Lentiviral Packaging System |
pPACK-SPIKE D614G, SARS-CoV-2 “S” Pseudotype – D614G Mutant – Lentivector Packaging Mix |
CVD19-530A-1 |
10 Rxns |
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pPACK-SPIKE D614G, SARS-CoV-2 “S” Pseudotype – D614G Mutant – Lentivector Packaging Mix (XL) |
CVD19-540A-1 |
25 Rxns |
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pPACK-SPIKE D614G Combo Kit, includes Cat# CVD19-530A-1, plus PureFection Transfection Reagent (Cat# LV750A-1) and PEG-it Virus Concentration solution (Cat# LV810A-1) |
CVD19-550A-KIT |
1 Kit |
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Envelope Protein-free Lentivector Packaging System (Negative Control) |
pPACK-BALD Envelope Protein-free Lentivector Packaging Mix |
LV550A-1 |
10 Rxns |
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pPACK-BALD Envelope Protein-free Lentivector Packaging Mix (XL) |
LV555A-1 |
25 Rxns |
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ACE2 Expression Lentivector, pCDH-CMV-ACE2-EF1α-Puro Plasmid |
CVD19-100PA-1 |
10 µg |
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ACE2 Expression Lentivector, pCDH-CMV-ACE2-EF1α-Puro Pre-packaged Virus |
CVD19-100VA-1 |
>2 x 10^6 IFUs |
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HEK293 ACE2 Stable Cell Line |
CVD19-200A-1 |
2 x 10^6 Cells |
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SARS-CoV-2 Nucleocapsid (N protein) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-N-EF1α-Puro Plasmid |
CVD19-120PA-1 |
10 µg |
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SARS-CoV-2 Nucleocapsid (N protein) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-N-EF1α-Puro Pre-packaged Lentivirus |
CVD19-120VA-1 |
>2 x 10^6 IFUs |
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SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein (S) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-S-EF1α-Puro Plasmid |
CVD19-130PA-1 |
10 µg |
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SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein (S) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-S-EF1α-Puro Pre-packaged Lentivirus |
CVD19-130VA-1 |
>2 x 10^6 IFUs |
細胞實驗研究工具
細胞實驗是生物醫學常被用來了解疾病致病機轉或者測試治療藥物之療效與毒性評估最常用的研究工具之一。傳統細胞實驗中，要了解細胞存活狀況或者是觀察細胞內的分子含量變化，常常需要添加分析試藥，或是使用免疫染色等技術來進行研究。而這些技術通常需要進行多重時間點 (time course) 以及藥物濃度 (Dose-dependent) 並且配合後續細胞樣品固定以及使用抗體染色進行免疫染色等實驗步驟方能完成分析。
I. Air Liquid Interface (ALI) Culture 氣液界面細胞培養
氣液界面細胞培養方法為使細胞的基底表面與培養基接觸，讓細胞可正常生長，而細胞層的頂部暴露在空氣中。小呼吸道上皮細胞 (SAEC) 和人類支氣管上皮細胞 (HBE) 可以在 ALI 培養基系統中進行高度分化，在分化時緊密連結並在細胞表面形成類似氣管上皮的假複層上皮的粘液纖毛表型，模擬真實人類細胞狀況。是絕佳的生物學體外模型工具。
Lonza Primary Cell
- 組織來源：肺遠端部分的 1 mm 細支氣管/肺分支上方的氣道上皮內膜層
- 經 ALI 培養驗證，具有纖毛產生，粘蛋白生成或 TEER 值為特徵的分化
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品名 |
貨號 |
包裝 |
培養基 |
SAEC-Small Airway Epithelial Cells for S-ALI |
CC-2547S |
≥500,000 cells |
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NHBE-Human bronchial/Tracheal Epithelial Cells for B-ALI |
CC-2540S |
≥500,000 cells |
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D-HBE-As-Diseased Human bronchial/Tracheal Epithelial Cells – Asthma for B-ALI |
00194911S |
≥500,000 cells |
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D-HBE-COPD-Diseased Human bronchial/Tracheal Epithelial Cells – COPD for B-ALI |
00195275S |
≥500,000 cells |
Merck Cell Line
- 已有70 篇文獻使用 16HBE14o-human bronchial epithelial cell line 進行 SARS 研究
- 應用層面廣，可做為肺癌研究或肺部纖維化、肺部損傷/修復，呼吸道傳染疾病等研究
- 具備可形成 Tight Junction 以及 polarity 等重要呼吸道上皮細胞特性
- 能表現 Wild-type CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 蛋白
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品名 |
貨號 |
包裝 |
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SCC150 |
≥1,000,000 cells |
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SCCE009 |
≥500,000 cells |
Millicell ERS-2 Voltohmmeter
TEER (Transepithelial/transendothelial electrical resistance) 是一種廣泛被使用來偵測內皮細胞和上皮單層細胞是否緊密接合 (tight junction) 的一種定量技術。也是用來評估藥物或化學品運輸前，細胞屏障是否為完整性的一個有力的指標。
TEER 是一種廣泛被接受的電學參數，通常測量歐姆電阻或測量寬頻範圍內的電阻抗，與傳統的滲透率測量相比，TEER 測量具有優勢，它是一種快速也可定量的方法。
- 簡單：只需要將電極棒置入 Insert 中，即可偵測歐姆電阻值
- 快速：well / < 1min 即可偵測完成。如需要使用 96 well plate 偵測，可選配 96 well 專用的電極棒
- 應用：可測量單層細胞完整性 ( Cellular monolayer integrity ) ，細胞藥物運輸 ( Drug Transport )
- 屏障模型的包括：血腦屏障 ( Blood-Brain Barrier; BBB ) 、胃腸道 ( GI ) 和肺模型
- 需搭配 Millicell insert 一起使用
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品名 |
貨號 |
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MERS00002 |
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MERSBAT01 |
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Specialized Electrodes (for Millicell-96 well plate only), 1 pair |
MERSSTX00 |
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MERSSTX01 |
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MERSSTX03 |
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MERSSTX04 |
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Millicell Hanging Cell Culture Insert, PET 0.4 µm, 6-well, 48/pk |
PTHT06H48 |
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Millicell Hanging Cell Culture Insert, PET 0.4 µm, 12-well, 48/pk |
PTHT12H48 |
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Millicell Hanging Cell Culture Insert, PET 0.4 µm, 24-well, 48/pk |
PTHT24H48 |
II. Biosensor 生物感測器
BiotrackerTM 是一系列的活細胞分子偵測染劑，不只能針對不同的胞器進行追蹤，也可以針對特殊分子進行染色。例如: 核苷酸、活性氧分子、二價鈣/鐵/鋅離子、以及細胞增生/凋亡/缺氧和神經突觸活性相關之分子。
- 細胞毒性低
- 具有細胞膜穿透性的特色
- 含有多種不同螢光，方便搭配其他標的物螢光選擇
- 螢光訊號維持長，方便觀察細胞變化
A. 細胞胞器研究
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胞器選擇 |
品名 |
Excitation (nm) |
Emission (nm) |
貨號 |
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Membrane |
484 |
501 |
SCT106 |
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549 |
565 |
SCT107 |
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644 |
665 |
SCT108 |
||
|
366 |
441 |
SCT109 |
||
|
683 |
724 |
SCT112 |
||
|
748 |
780 |
SCT113 |
||
|
767 |
806 |
SCT114 |
||
|
786 |
820 |
SCT115 |
||
|
Nucleus |
662 |
694 |
SCT117 |
|
|
662 |
694 |
SCT118 |
||
|
650 |
675 |
SCT119 |
||
|
500 |
515 |
SCT120 |
||
|
Mitochondria |
402 |
440 |
SCT135 |
|
|
490 |
523 |
SCT136 |
||
|
622 |
648 |
SCT137 |
||
|
Cytoskeleton |
500 |
515 |
SCT142 |
|
|
358 544 |
461 570 |
FAK100 |
||
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Lysosomes |
535 |
560 |
SCT019 |
|
|
634 |
659 |
SCT138 |
||
|
554 |
583 |
SCT140 |
||
|
541 |
634 |
SCT141 |
||
|
375 |
500 |
SCT044 |
||
|
Lipids |
427 |
585 |
SCT144 |
B. 細胞缺氧 (Hopoxia) 研究
EF5 Hypoxia Detection Kit
(Cat. # EF5-30A4)
EF5 是由 Dr. Cameron Koch 及 Dr. Sydney Evans 所開發的化合物，它會選擇性的結合低氧細胞並形成複合物，然後利用鍵結Alexa Fluor® 488 的單株抗體來專一性辨識 EF5。
- 不帶電荷，可快速又均勻的分佈在組織或細胞中
- 靈敏度高：可藉由 EF5 結合的螢光來半定量組織中的氧含量
BioTracker 520 Green Hypoxia Dye
(Cat. # SCT033)
BioTracker 520 Green Hypoxia Dye 在低氧環境下，會與還原酶反應轉變成可激發螢光的分子結構。在低氧環境下靈敏度比 pimonidazole 高出許多，在 5% 氧氣濃度下，即可偵測高強度螢光。
- 不須固定細胞
- 靈敏度高: 只需 5% 的氧濃度即可偵測
III. Receptor/Ligand interaction 受體/配體交互作用
Duolink® PLA (Proximity Ligation Assay)
Duolink® PLA 是一種創新的研究蛋白質交互作用的工具。一般常用的 IP 或Western 雖然廣泛的被使用在研究蛋白質交互作用上，但礙於偵測靈敏度及需要先萃取出樣品蛋白，而無法得知蛋白質交互作用的實際位置。利用 Duolink® PLA 可將蛋白質信號放大 1000 倍，讓您可以在原生細胞內直觀地檢測蛋白質及其相互作用。
-
單細胞即可偵測
-
不須額外的實驗設備: IHC, ICC, flow 即可進行偵測
-
多種螢光選擇: Green, Orange, Red, Far Red, Violet (for flow)
-
訊號可被放大 1000 倍
-
高專一性: 利用兩隻一級抗體以及兩股探針作用，增加專一性
-
數千篇文獻採用
蛋白質交互作用比較表
輕鬆上手入門款：內含實驗所需試劑和 buffer
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品名 |
品號 |
包裝 |
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DUO92101-1KT |
30 rxn |
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DUO92102-1KT |
30 rxn |
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DUO92103-1KT |
30 rxn |
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DUO92104-1KT |
30 rxn |
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DUO92105-1KT |
30 rxn |
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DUO92106-1KT |
30 rxn |
流式細胞儀專區：
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品名 |
品號 |
包裝 |
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DUO94001-40TST |
40 Tests |
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DUO94002-40TST |
40 Tests |
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DUO94003-40TST |
40 Tests |
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DUO94004-40TST |
40 Tests |
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DUO94005-40TST |
40 Tests |
自行搭配進階款：自行選擇螢光鍵結想要接的二抗
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品名 |
品號 |
包裝 |
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DUO96000-30RXN |
30 rxn |
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Duolink™ PLA Multicolor Probemaker Kit - Red Proximity Ligation Assay Multiplexing |
DUO96010-30RXN |
30 rxn |
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Duolink™ PLA Multicolor Probemaker Kit - Green Proximity Ligation Assay Multiplexing |
DUO96020-30RXN |
30 rxn |
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Duolink™ PLA Multicolor Probemaker Kit - Orange Proximity Ligation Assay Multiplexing |
DUO96030-30RXN |
30 rxn |
|
Duolink™ PLA Multicolor Probemaker Kit - Far Red Proximity Ligation Assay Multiplexing |
DUO96040-30RXN |
30 rxn |
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