研究病毒感染機制:病毒分離及培養
引起 COVID-19 的 SARS-CoV-2 病毒,可由實驗室分離出來後再提供給科學、醫學界進行更深入的研究。得到的病毒株以利於更精準的檢測試劑及疫苗的研發及協助作為抗病毒藥物篩選的工具。依據疾病管制署公告的 「醫學實驗室處理嚴重特殊傳染性肺炎檢體之實驗室生物安全指引」,SARS-CoV-2 病毒培養須在 BSL-3 實驗室下進行,以提高生物安全防護。
目前用於分離 SARS CoV-2 病毒的細胞有 Vero E6、Vero-CCL81 及 Human Lung Cell Huh-7 等細胞株。可將帶有病毒之檢體接種於上述的細胞,於 37°C, 5% CO2 培養箱進行培養,進行細胞病變 (Cytopathic Effect) 的每日觀察,於 3 天後可明顯觀察到細胞變圓及聚集的細胞病變 (下圖中的 b, B),培養的上清液與細胞分別以 RT-PCR 及使用 SARSr-CoV Rp3 NP antibody 進行免疫螢光染色確認病毒。
(圖片出處:A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579(7798): 270–273.)
(圖片出處:Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with Coronavirus Disease, United States. Emerg Infect Dis. 2020 Jun;26(6):1266-1273.)
(圖片出處:Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea. J Korean Med Sci. 2020 Feb 24; 35(7): e84.)
應用 |
品名 |
貨號 |
包裝 |
哺乳類細胞 |
85020206-1VL |
1 vial |
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哺乳類細胞 |
08011101-1VL |
1 vial |
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培養液 |
BEBP02-030Q |
1 L |
溶菌斑實驗(Plaque Assay)
1917 年法國科學家狄艾勒 (d’Herelle) 發現病毒除非在消耗活細菌的情況之下,否則是無法複製的;因此稱之為噬菌體 (bacteriophage; phage),並提供了檢測此等病原的方法,其中被廣泛使用且效果最佳者為溶菌斑實驗 (plaque assay)。每一個噬菌體在宿主上都能形成一個清晰容易區別的噬菌斑,噬菌斑的數目與加入的噬菌體稀釋度成反比,因此噬菌體的效價可以根據斑點形成單位 (plaque forming units; pfu) 來推算。
Graphical protocol overview of two plaque assay methods for the quantification of infectious SARS‐CoV‐2.
(圖片出處: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cpmc.105)
此圖使用 Huh 7 cell line/人類肝癌細胞株,並用冠狀病毒系列的 coronavirus 229E 感染,之後再用結晶紫(crystal violet) 將活細胞染成紫色。圖中任一個非紫色的圓形,理論上可被視為被一顆病毒感染、破壞後的痕跡。圖中可見 4 個 wells 幾乎沒有細胞,病毒以將該 well 的細胞幾近都殺死。
(圖片出處: https://rcevi.cgu.edu.tw/p/16-1030-74120.php?Lang=zh-tw)
SeaPlaqueTM Agarose
- 低熔點:≦ 65℃ at 1.5%
- 200 bp - 25 kb 有很好的高分離解析度
- 低凝膠溫度:26-30℃ at 1.5%
- 凝膠強度:g/cm2 ≧ 200 at 1%
- EEO (-mr) electroendosmosis:≦ 0.10
References
- A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579(7798): 270–273.
- Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with Coronavirus Disease, United States. Emerg Infect Dis. 2020 Jun;26(6):1266-1273
- Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea. J Korean Med Sci. 2020 Feb 24; 35(7): e84.
- 社團法人台灣醫事檢驗學會
- WHO
- US CDC
- Taiwan CDC
- https://rcevi.cgu.edu.tw/p/16-1030-74120.php?Lang=zh-tw
- https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cpmc.105